引言:
胆汁酸是胆汁的主要功能成分，参与肝肠循环。肝胆疾病引起胆汁酸肝肠循环障碍，造成人体胆汁酸含量异常，而胆汁酸含量变化也会影响人体胆汁酸的合成和分泌。因此胆汁酸含量是衡量肝胆功能正常与否的重要标志物。
目前，胆汁酸检测的主要应用场景为妊娠期肝内胆汁酸淤积症（Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy, ICP）的筛查。ICP是一种妊娠期特有的疾病，多发生在妊娠中、晚期，发病率为0.8%-12%，主要危害胎儿，引起胎儿窘迫、早产、死胎、死产，使围产儿患病率及死亡率明显增加，是导致围产儿病死率升高的主要原因之一。
胆汁酸分析方法主要包括GC法、GC-MS法、HPLC法和LC-MS/MS法。临床上针对15种胆汁酸主要使用LC-MS/MS法进行分析测定，该方法简便、灵敏，特异性好。因此，本方法采用ANYEEP TQ9100液相色谱串联质谱系统，测定人血清中胆酸（CA）、甘氨胆酸（GCA）、牛磺胆酸（TCA）、脱氧胆酸（DCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、熊脱氧胆酸（UDCA）、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA）、牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA）、石胆酸（LCA）、甘氨石胆酸（GLCA）、牛石氧胆酸（TLCA）。
实验部分:
样品处理：取待测样本100μL，加入20μL内标，380μL乙腈，涡旋混匀并离心（4℃，15000rpm，5min）；取上清液400μL于96孔板中，40℃氮吹至干；加入100μL复溶液（50%乙腈），置于微孔板震荡仪上1200rpm/min震摇5min，4000rpm离心5min，5μL进样。
色谱条件：色谱柱使用Agilent Poroshell 120 EC C18 column 2.1mm×100mm 1.9μm进行液相分离，流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈，柱温40℃，梯度设置见表1。
质谱条件：采用电喷雾离子化源负离子（ESI-）模式和多反应监测模式（MRM）进行质谱扫描。离子化源温度550℃，喷雾电压-4500V，气帘气10psi，雾化气50psi，辅助加热气55psi，碰撞气8，EP -10V，CXP -8V。各化合物定量离子对参数见表2。
表1-梯度洗脱条件
| 时间 | 流速 | A组 | B组 |
| min | mL/min | % | % |
| 0 | 0.5 | 60 | 60 |
| 2 | 0.5 | 50 | 50 |
| 3.5 | 0.5 | 15 | 85 |
| 4 | 0.5 | 10 | 90 |
| 4.1 | 0.5 | 2 | 98 |
| 4.5 | 0.5 | 2 | 98 |
| 4.6 | 0.5 | 60 | 40 |
| 6 | 0.5 | 60 | 40 |
表2-15种胆汁酸及内标MRM离子对参数
| 待测物名称 | Q1离子 | Q3离子 | 驻留时间 ms | DP (V) | CE (V) |
| CA | 407.3 | 407.3 | 30 | -200 | -35 |
| CA-d4 | 411.3 | 411.3 | 30 | -200 | -35 |
| DCA/CDCA | 391.31 | 391.31 | 30 | -200 | -35 |
| DCA/CDCA-d4 | 395.31 | 395.31 | 30 | -200 | -40 |
| UDCA | 391.3 | 391.3 | 30 | -200 | -5 |
| UDCA-d4 | 395.3 | 395.3 | 30 | -200 | -5 |
| LCA | 375.4 | 375.4 | 30 | -200 | -10 |
| LCA-d4 | 379.3 | 379.3 | 30 | -150 | -15 |
| GCA | 464.3 | 74.0 | 30 | -200 | -80 |
| GCA-d4 | 468.3 | 74.0 | 30 | -200 | -80 |
| GLCA | 432.4 | 74.1 | 30 | -150 | -80 |
| GLCA-d4 | 436.4 | 74.1 | 30 | -150 | -80 |
| GDCA/GCDCA/GUDCA | 448.4 | 74.0 | 30 | -150 | -80 |
| GCDCA/GUDCA-d4 | 452.4 | 74.0 | 30 | -150 | -80 |
| TCA | 514.3 | 80.1 | 30 | -200 | -80 |
| TCA-d4 | 518.3 | 80.0 | 30 | -200 | -80 |
| TDCA/TCDCA/TUDCA | 498.3 | 80.0 | 30 | -150 | -80 |
| TDCA/TCDCA/TUDCA-d4 | 502.3 | 80.0 | 30 | -150 | -80 |
| TLCA | 482.4 | 80.0 | 30 | -200 | -80 |
| TLCA-d4 | 486.4 | 80.0 | 30 | -200 | -80 |
结果与讨论:
15种胆汁酸提取离子图见图1，保留时间、线性范围、回归方程（权重1/x2）、精密度（以RSD%计）和准确度（以回收率%计）见表3。
从表中可见，回归方程r2均大于0.99（即r大于0.995），低浓度和高浓度的精密度（RSD%）均小于10%，回收率在92.2%-106.9%之间。
表3-15种胆汁酸保留时间、线性范围、回归方程、精密度和准确度结果
| 化合物 | 保留时间 min | 线性范围 nM | 回归方程 | 相关系数 r2 | RSD% | 回收率% |
| TUDCA | 0.972 | 2-200 | Y=0.012892X+0.011681 | 0.9935 | 5.2 | 106.2 |
| 5.0 | 104.3 | |||||
| TCA | 1.009 | 5-500 | Y=0.011281X+0.010229 | 0.9967 | 3.7 | 99.5 |
| 3.3 | 93.6 | |||||
| GUDCA | 1.384 | 25-2500 | Y=0.002581X+0.009855 | 0.9987 | 4.1 | 104.4 |
| 2.7 | 97.1 | |||||
| GCA | 1.402 | 40-4000 | Y=0.002141X+0.011291 | 0.9988 | 3.2 | 103.0 |
| 3.1 | 95.9 | |||||
| TCDCA | 1.421 | 20-2000 | Y=0.001623X+0.007608 | 0.9979 | 2.3 | 103.6 |
| 2.6 | 97.6 | |||||
| TDCA | 1.571 | 10-1000 | Y=0.002359X+0.083276 | 0.9998 | 5.4 | 100.7 |
| 2.3 | 98.5 | |||||
| CA | 2.170 | 5-500 | Y=0.008214X+0.008745 | 0.9940 | 3.9 | 106.9 |
| 3.2 | 96.1 | |||||
| GCDCA | 2.282 | 60-6000 | Y=0.001859X+0.008745 | 0.9988 | 3.8 | 106.6 |
| 2.9 | 98.4 | |||||
| UDCA | 2.301 | 5-500 | Y=0.037890X+0.118724 | 0.9971 | 8.1 | 101.6 |
| 4.5 | 92.2 | |||||
| GDCA | 2.507 | 60-6000 | Y=0.002012X-0.002509 | 0.9985 | 3.0 | 105.4 |
| 4.7 | 97.2 | |||||
| TLCA | 2.525 | 2-200 | Y=0.010689X+0.016102 | 0.9943 | 2.3 | 108.7 |
| 3.4 | 101.9 | |||||
| CDCA | 3.386 | 15-1500 | Y=0.025979X-0.033765 | 0.9915 | 6.9 | 106.1 |
| 8.2 | 97.2 | |||||
| DCA | 3.499 | 10-1000 | Y=0.012683X+0.043749 | 0.9969 | 4.1 | 104.9 |
| 6.0 | 97.9 | |||||
| GLCA | 3.555 | 5-500 | Y=0.007463X+0.002849 | 0.9990 | 3.0 | 104.8 |
| 5.0 | 95.9 | |||||
| LCA | 4.266 | 3-300 | Y=0.028897X+0.107925 | 0.9904 | 6.9 | 99.3 |
| 9.6 | 101.4 |
a,b 上行数据为低浓度，下行数据为高浓度，低浓度为线性范围下限的3倍，高浓度为线性范围上限的70%
图1-15种胆汁酸基质加标提取离子图
总结
本方法使用安益谱全自主研发生产的TQ 9100三重四极杆串联质谱系统，实现了血浆中15种胆汁酸的同时检测，该方法线性好、准确度高、特异性强，每个样本分析仅需6分钟，具有较高的通量，适合临床检测分析。
