三重四极杆液质联用仪-ANYEEP TQ9100液相色谱串联质谱系统测定人血清中脂溶性维生素含量
摘要：本研究旨在建立一种基于液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术同步测定人血清中五种脂溶性维生素的分析方法。采用安益谱TQ9100三重四极杆串联质谱系统，通过优化样品前处理、色谱分离及质谱检测条件，实现了维生素A（VA）、25-羟基维生素D2（25(OH)D2）、25-羟基维生素D3（25(OH)D3）、维生素E（VE）和维生素K1（VK1）的同时定量分析。该方法创新性地兼容电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）两种离子源，无需更换离子源或调整色谱条件即可完成检测。方法学验证结果显示，各待测物在相应线性范围内相关系数（r）均大于0.995，批内精密度相对标准偏差（RSD）小于10%（VK1在ESI源低浓度点除外），准确度回收率为90.5%~105.6%。该方法具有操作简便、通量高、准确性好的特点，适用于临床样本中脂溶性维生素的营养水平评估。
关键词：脂溶性维生素；液相色谱-串联质谱；电喷雾电离；大气压化学电离；方法学验证
1 引言
脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K，在人体生长发育、免疫调节、凝血功能及抗氧化防御等生理过程中发挥关键作用。其缺乏症通常呈渐进性发展，早期临床表现隐匿，但长期亚临床水平不足可导致特异性病理改变，如维生素A缺乏引发夜盲症、维生素D缺乏影响骨骼矿化、维生素E异常与生殖功能障碍相关、维生素K不足则损害凝血功能。因此，建立灵敏、准确的血清脂溶性维生素检测方法对于营养状态评估、疾病风险预警及个性化补充指导具有重要意义。
传统检测方法存在诸多局限：免疫分析法易受交叉反应干扰且无法实现多组分同步分析；高效液相色谱法灵敏度不足，难以满足痕量组分检测需求。液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）凭借其高选择性、高灵敏度及多反应监测（MRM）能力，已成为维生素检测的"金标准"。然而，不同维生素的理化性质差异显著，尤其是维生素K1极性较弱，在ESI源中离子化效率较低，常需切换至APCI源以提升检测性能，但离子源更换过程繁琐且易导致方法重现性下降。
本研究利用ANYEEP TQ9100 LC-MS/MS系统，优化建立了一套同时兼容ESI与APCI源的血清脂溶性维生素检测方法，通过单次样本前处理实现五种维生素的同步提取与测定，为临床实验室提供了灵活高效的技术解决方案。
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂
仪器：ANYEEP TQ9100三重四极杆串联质谱仪（安益谱，中国），配电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）；Phenomenex Kinetex F5色谱柱（3.0 mm×50 mm，2.6 μm）；全自动氮吹仪；微孔板振荡仪；高速冷冻离心机。
试剂：甲醇、异丙醇、乙腈为质谱纯；甲酸为分析纯；脂溶性维生素标准品及其氘代内标（VA-d6、25(OH)D2-d3、25(OH)D3-d6、VE-d6、VK1-d4）购自Sigma-Aldrich；超纯水由Millipore纯化系统制备。
2.2 样品前处理
取200 μL人血清样本置于1.5 mL EP管中，依次加入20 μL混合内标工作液和400 μL异丙醇，涡旋混匀（2500 rpm，5 min）以沉淀蛋白并提取目标物。随后在4℃下以14,000 rpm离心5 min，转移500 μL上清液至96孔板中，于40℃氮气流下吹干。向吹干后的残渣中加入100 μL复溶液（乙腈-水，50:50，v/v），在微孔板振荡仪上以2000 rpm振摇2 min复溶，最后以4000 rpm离心5 min，取上清液进样分析。
2.3 色谱条件
2.4 质谱条件
表2 脂溶性维生素及内标的MRM参数
2.5 方法学验证
按现行生物分析方法验证指南要求，系统考察了方法的线性范围、定量下限、精密度与准确度、回收率及基质效应。以氘代内标校正，采用加权最小二乘法（权重1/x²）建立校准曲线。精密度与准确度实验分别考察了低、高两个浓度水平（低浓度为线性下限的3倍，高浓度为线性上限的70%），每个浓度日内重复测定6次，连续测定3天。
3 结果
3.1 色谱分离与选择性
在优化条件下，五种脂溶性维生素及内标均获得良好分离，基质干扰可忽略不计。
3.2 线性范围与定量下限
如表1所示，五种维生素在各自线性范围内呈现良好线性关系，相关系数平方（r²）均大于0.99（r>0.995）。VA、25(OH)D2、25(OH)D3、VE和VK1的线性范围分别为20~2000 ng/mL、1~50 ng/mL、1~100 ng/mL、200~20000 ng/mL和0.1~5 ng/mL，覆盖临床决策所需浓度区间。
3.3 精密度与准确度
日内和日间精密度实验中，除VK1在ESI源低浓度点（0.3 ng/mL）RSD为17.9%外，其余各化合物在低、高浓度水平的RSD均小于10%，表明方法具有良好的重复性。准确度考察结果显示，所有化合物的回收率介于90.5%~105.6%之间，符合生物样品分析要求。
表1 方法学验证结果汇总
| 化合物 | 保留时间(min) | 线性范围(ng/mL) | 回归方程 | r² | RSD% | 回收率% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 低/高 | 低/高 | |||||
| VA | 2.843 | 20-2000 | Y=0.002006x+0.045044 | 0.9997 | 7.1/6.5 | 102.9/99.2 |
| VA | 2.449 | 40-2000 | Y=0.002166x+0.035214 | 0.9979 | 4.2/5.5 | 99.2/103.1 |
| 25(OH)D2 | 2.760 | 1-50 | Y=0.014762x+0.020829 | 0.9984 | 8.8/4.9 | 95.2/96.0 |
| 25(OH)D2 | 2.469 | 1-50 | Y=0.019129x+0.035112 | 0.9986 | 5.2/7.4 | 105.1/100.0 |
| 25(OH)D3 | 2.718 | 1-100 | Y=0.013547x+0.033252 | 0.9994 | 5.5/3.9 | 99.5/95.0 |
| 25(OH)D3 | 2.379 | 2-100 | Y=0.014289x+0.011085 | 0.9996 | 4.1/6.9 | 105.6/102.1 |
| VE | 4.110 | 200-20000 | Y=0.000291x+0.021601 | 0.9992 | 5.4/6.1 | 99.3/96.7 |
| VE | 4.258 | 400-20000 | Y=0.001055x-0.044219 | 0.9911 | 9.1/5.9 | 101.1/90.5 |
| VK1 | 4.152 | 0.1-5 | Y=0.156314x+0.008712 | 0.9968 | 17.9/7.4 | 94.2/97.0 |
| VK1 | 4.459 | 0.1-5 | Y=0.274144x+0.008196 | 0.9929 | 6.6/5.9 | 97.3/98.9 |
注：低浓度为线性范围下限的3倍，高浓度为线性范围上限的70%
4 讨论
本研究建立的LC-MS/MS方法通过单次蛋白沉淀-液液萃取前处理，实现了五种脂溶性维生素的高效提取。异丙醇作为提取溶剂，不仅能有效沉淀血清蛋白，还可最大限度减少脂质共提取，降低基质效应。96孔板自动化操作流程进一步提升了样品通量，适用于大规模流行病学调查或临床常规检测。
方法的核心创新在于实现了ESI与APCI源的无缝兼容。传统方法需根据化合物性质切换离子源，导致方法开发复杂、维护成本增加。本研究通过优化流动相梯度和流速组合，使色谱行为与两种离子化过程相匹配，用户可根据实际需求灵活选择电离模式而无需改变硬件配置。对于常规检测，ESI源即可满足大部分需求；当遇到低浓度VK1样本或需更高灵敏度时，可便捷切换至APCI源。
5 结论
本研究成功建立并验证了一种基于ANYEEP TQ9100系统的血清脂溶性维生素同步检测方法。该方法线性范围宽、准确度高、前处理简便，最重要的是创新性地实现了ESI与APCI双源兼容，为临床实验室提供了灵活、高效的技术选择。本方法可满足维生素营养状态评估的临床需求，具有良好的应用推广价值。
未来研究可进一步探索该方法在干血斑样本或其他生物基质中的适用性，并考察更多脂溶性维生素类似物（如维生素K2、25(OH)D的差向异构体）的分离检测能力，以拓展其应用范围。
